免疫学诊断是基于免疫学原理，又与细胞生物学、分子生物学和计算机科学等多种学科相互渗透、相互融合而发展起来的应用非常广泛的一类诊断技术。 免疫学诊断技术仍在快速更新和发展着，新方法层出不穷。

体外抗原抗体反应是抗原与相应抗体在体外的特异性结合反应。 由于参与反应的抗原物理性状以及其他反应条件的不同，可出现不同的现象，如凝集、沉淀、标记物阳性等。 换言之，体外抗原抗体反应的原理就是抗原抗体结合的特异性及可见性。 由于抗体主要来自于血清，因此又将体外抗原抗体反应称为血清学反应。

抗原抗体反应的特异性是指抗体只能与诱导其产生的抗原发生结合的特性。 然而，当两种不同的抗原物质具有某些相同或相似的抗原表位时，能与彼此相应的抗体出现交叉反应。

抗原抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原和抗体的特性。 其基本原理是抗原抗体的结合属非共价键结合。 解离后的抗原或抗体仍然保持游离抗原或抗体的生物学活性。

在一定条件下，抗原抗体结合能够出现肉眼可见的现象称为可见性。 可见性出现的条件除抗原抗体必须相应外，抗原抗体二者的浓度、比例适当也至关重要。 原因是天然抗原大多是多价的，抗体大多为二价，只有当抗原抗体二者的浓度、比例适当时，才可互相结合成为立体结构的巨大网格状复合物，出现肉眼可见的凝集或沉淀现象。

由于抗原抗体检测的方法不断更新，现代抗原抗体反应的观察结果已不依赖于抗原抗体结合本身出现的凝集、沉淀等特有现象，而逐渐被一些特殊的标记物及其相关产物所取代，如：酶的催化产物、荧光物质、同位素、胶体金颗粒、化学发光物质等，也正因为如此，抗原抗体反应的检测灵敏度得到了极大提高。

抗原的理化性状，如颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀现象；单价抗原与相应抗体结合不出现肉眼可见现象。 因为抗原抗体反应体系中二者浓度比例适当才能出现肉眼可见现象，因此在抗原抗体反应时，应根据具体情况，稀释抗原或抗体，以调整二者的比例。

酸碱度、离子强度和温度是影响抗原抗体反应的重要因素。 如：在抗原抗体反应体系中，常使用0.85% NaCl 作为抗原抗体的稀释液和反应液；抗原抗体反应一般以pH6～9 为宜；合适的温度一般以15～40℃为宜，最适温度通常为37℃。 温度越低，反应速度越慢，但抗原抗体结合越牢固，更易于观察，有时也选择之。 某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。 适当的机械性搅拌和震荡可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。

可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等）与相应抗体体外结合，在一定条件下出现沉淀物的现象称为沉淀反应（precipitation）。 沉淀反应可检测到20μg/ml ～2mg/ml 水平的抗体或抗原。 沉淀反应多数在半固体琼脂凝胶为介质的环境中进行。

是将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将一定体积的待测抗原标本加入孔中扩散的一种定量试验。 待测抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。 该法可用于测定血清中IgG、IgM、IgA 和补体C3 等的含量。

是将含抗原与抗体的标本分别加入琼脂凝胶的小孔中，抗原抗体均自由向四周扩散的一种方法。 抗原抗体相互扩散过程中彼此相遇，则小孔间形成白色沉淀线，如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉淀线。 本法可用于抗原或抗体的定性、定量检测以及组分分析。

是将区带电泳和双向免疫扩散相结合的一种方法。 先将待检标本作琼脂凝胶电泳，标本中的各蛋白组分各自电泳到不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与已分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应位置形成沉淀弧。 通过与正常对照标本形成的沉淀弧数量、位置和形态进行比较，可分析标本中所含抗原成分。 该法常用于观察免疫球蛋白（包括免疫球蛋白的类、亚类及型）的异常增多或缺失，亦可用于分析血清蛋白组分，鉴定提取物纯度等。

是无需琼脂凝胶而在液相中进行的一种沉淀反应。 在一排含有相同量抗体的标本中，分别加入不同稀释度的标准抗原和待测抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物。 利用浊度计测定反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，因此待测抗原的量可通过由不同稀释度的标准抗原及相应浊度绘制的工作曲线查得。 该法快速简便，易自动化，可取代单向免疫扩散定量测定标本中的抗原含量。

颗粒性抗原（完整的细菌、红细胞等）与相应抗体体外结合，在一定条件下出现凝集物的现象称为凝集反应（agglutination）。 凝集反应可检测到1μg/ml 水平的抗体。

将细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集的现象。 一种方法是在玻片上进行的玻片凝集试验，用于定性测定抗原，如ABO 血型鉴定、菌种鉴定。 另一种方法是在试管里进行的试管凝集试验，用于定量测定抗体或抗原，但常用于测抗体，方法是在试管中系列稀释待检血清，加入已知定量颗粒性抗原，出现明显反应的最高稀释度称为此待检血清的抗体效价或滴度（titer）。 由于倍比稀释跨度很大，这种测定只是半定量的。 诊断肠热症的肥达试验（Widal test）即属此类型。

将可溶性抗原（或抗体）包被至免疫无关颗粒（如Rh ^-O 型红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等）表面，使之称为致敏载体颗粒，再与相应抗体（或抗原）反应出现凝集物的现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。 前者为正向间接凝集反应（图9-1），后者为反向间接凝集反应。 临床上多种病原体的抗体、自身抗体和一些可溶性抗原的检测方法属此类型。

协同凝集试验的原理与反向间接凝集反应相似，只是载体改为金黄色葡萄球菌，此菌细胞壁中含葡萄球菌A 蛋白（staphylococcal protein A，SPA），能与人及多种哺乳动物IgG 抗体的Fc 段结合。 IgG 的Fc 段与SPA 结合后，其Fab 段仍能与特异性抗原结合并出现凝集现象。 本试验可用于检测血液、脑脊液和其他分泌液中的微量抗原，如肠热症、流脑、细菌性痢疾、布氏菌病等的早期诊断。

将可溶性抗原与相应抗体先充分反应，再加入抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现致敏颗粒的凝集，称为间接凝集抑制试验（图9-1）。 此法既可测抗原，亦可测抗体；既可定性测定，亦可定量测定。 用该法测标本中的未知抗原时，不发生凝集者为阳性，反之为阴性，免疫妊娠试验属此类型。

此方法由Coombs 建立，故亦称为Coombs 试验（Coombs test），是用于检测不完全抗体的一种凝集反应。 所谓不完全抗体是指虽与其相应颗粒性抗原结合，但不出现凝集现象的一类特殊抗体，原因是此类抗体为单价或抗体分子较小。 抗红细胞Rh 抗原的抗体就是一种不完全抗体。 Coombs 根据不完全抗体也是球蛋白的原理，用免疫动物的方法制备相应的抗球蛋白。 将此种抗球蛋白加入抗原与不完全抗体的复合物中，则可出现凝集现象。 抗球蛋白试验又可分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验两种。 前者用于检测结合状态的不完全抗体，即不完全抗体致敏的红细胞，如新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血等的检测；后者用于检测血清中游离的不完全抗体，如母体Rh 抗体的检测及Rh 血型鉴定。

检测中和抗体对外毒素和病毒毒性中和能力的一类试验。 须有易感细胞或易感动物的参与。

补体参与的抗原抗体反应主要是补体结合试验。 因其参与物质多，影响因素复杂，操作烦琐，已渐被其他方法取代。

免疫标记技术是用荧光素、酶、同位素等示踪物标记抗体或抗原后，进行的抗原抗体反应，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。 标记技术提高了检测的灵敏度；还具有快速、定性或定量，甚至定位等优点。

通常是指用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原进行鉴定和定位。 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。具体方法有直接荧光法和间接荧光法，前者用于检测标本中的抗原，后者既可用于检测抗原，亦可用于检测抗体（图9-2）。

是用酶标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，用于检测抗原或抗体。 它将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色来判定结果。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。 常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化技术。

是酶免疫分析中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将液相中的游离成分洗除，加入酶底物显色后判定结果。 可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值进行定量测定，敏感度可达ng/ml 甚至pg/ml 水平。 ELISA 方法很多，基本方法有：①双抗体夹心法，用于检测特异性抗原，将已知抗体包被在固相载体表面，加入待测抗原标本，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物后显色；目前包被抗体和酶标抗体常使用的是识别同一抗原分子不同抗原表位的两种单克隆抗体，待测抗原标本和酶标抗体可一次性加入，简化了操作流程，缩短了反应时间，称为双抗体夹心一步法。 ②间接法，用于检测特异性抗体，用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物显色（图9-3）。

是用酶标记的抗体与组织切片或其他标本中的抗原反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量、定位检测的技术。 现广泛应用的除酶免疫组化（酶标记）外，还有免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫荧光组化（荧光素标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、辣根过氧化物酶标记）等。

它将放射性同位素的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性相结合，使检测的灵敏度达pg/ml 水平，同时具备重复性好、样品及试剂用量少、操作简单、易标准化及自动化等优点。 缺点是需特殊的仪器设备，有一定的放射性危害。 常用的放射性同位素有 ¹²⁵I 和 ¹³¹I。 该技术已成为检测微量和超微量生物活性物质的有效手段，如检测激素、小分子药物、肿瘤标志物、酶、IgE 等。

除上述荧光素、酶、放射性同位素三大标记技术外，广泛应用的还有胶体金颗粒标记技术、化学发光物质标记技术以及电子致密物质标记的免疫电镜技术。

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B 细胞的主要功能是产生抗体。 如上所述，抗体的检测方法已非常成熟。 然而，无论从细胞表面标记，还是从功能角度讲，T 细胞都是异质性非常强的一类细胞，其测定的指标体系复杂，方法不易标准化。

体外检测T 淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法，该法获得的PBMC，分离纯度可达95%。 之后，可选用Percoll 分离液或贴壁黏附法等处理获得的PBMC 进一步得到纯化的淋巴细胞。 分离T 细胞或B 细胞，则可选用E 花环沉降法或尼龙毛柱分离法。 若要分离鉴定T 细胞的亚群，常选用以下方法。

常用免疫荧光法检查淋巴细胞的特殊表面标记，以鉴定细胞亚群。 如CD4 ⁺和CD8 ⁺T 细胞亚群、CD4 ⁺CD25 ⁺T 细胞亚群。

是借助流式细胞仪（flow cytometer，FCM）对免疫细胞及其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。 流式细胞仪集光学、流体力学、电子学和计算机技术于一体，对细胞做多参数定量测定和综合分析，包括细胞大小、核型、表面分子种类等。 样品经一种或多种荧光抗体染色，能同时分析细胞表面多个分子的表达及表达程度。 此外，该法还能以每秒约5000～10 000 个细胞的速度无菌分类收集所需的细胞，分选纯度在95%以上，而且可保持细胞活性，供进一步研究使用。

亦称T 细胞转化试验。 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A）等丝裂原以及抗CD3 单克隆抗体等能非特异活化培养的T 细胞，并使其增殖。 在增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态向淋巴母细胞转化，最终细胞分裂。 可通过形态学检查法、 ³H-TdR 掺入法和MTT 法进行检测。

T 细胞增殖试验也可检测特异性抗原致敏的T 细胞，只是在培养细胞中加入的是特异性抗原，只有已被该抗原致敏的T 细胞发生增殖反应，因而反映的是机体的特异性细胞免疫功能。

CTL、NK 细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等。 该试验用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面的研究。 具体检测方法有： ⁵¹Cr 释放法、乳酸脱氢酶释放法和凋亡细胞检查法等。

吞噬细胞包括单核巨噬细胞（大吞噬细胞）和中性粒细胞（小吞噬细胞）两类，主要功能有：趋化、吞噬和杀伤作用。

采用体内试验法（皮窗试验）和体外试验法（Boyden 小室法又称滤膜小室法、琼脂糖凝胶平板法）。

采用显微镜检法（计算吞噬率和吞噬指数）、硝基蓝四氮唑（nitroblue tetrazolium，NBT）还原试验和化学发光法。

采用鸡红细胞吞噬试验（计算吞噬率和吞噬指数）、巨噬细胞特定酶的检测和巨噬细胞分泌细胞因子的检测。

近年来用单克隆抗体检测吞噬细胞表面的黏附分子，对了解吞噬细胞功能缺陷的精确度更高。 如：可用流式细胞仪检查CD18、CD11、CD62L 等黏附分子的表达。

理论与实践